世界最资讯丨到底什么样的显微镜,可以拍摄到动物大脑?
NaturePortfolio© 2023-04-27 15:27:08

在自己开发的显微镜下看到蓝绿交织、眼花缭乱的脑细胞时,有那么一瞬间宗伟健感觉势不可当。“我有种感觉,如果成功开发了,就没什么做不到的。”他说。

这个瞬间发生于前年三月,它值得召开一次实验室临时会议,还需要一场庆祝会。宗伟健是挪威科维理系统神经科学研究所的光学工程师,在向同事展示最新数据前,他换上了白衬衫、打了领带。他说这就是他“玩具变工具”的时刻。

这个“玩具”是拇指大小的双光子荧光显微镜。它能照亮并记录活体组织,其显示深度是传统荧光显微镜无法达到的。Mini2P仅重2.4克,可贴于小鼠头部,并能追踪几百甚至上千个神经元在动物跑步、爬行、从平台跳跃时的活动[1]。宗伟健和同事在小鼠大脑的视觉区、记忆区、导航区都测试了这一设备,对细胞的探测最深达半毫米。


【资料图】

Mini2P是一种双光子显微镜,很小很轻,能戴在动物头上。图源:宗伟健/科维理系统神经科学研究所

它的定制镜片能对同一群细胞持续追踪长达一小时,或在数周里多次追踪。这种显微镜配上定制镜片,比头戴式单光子“微型”显微镜产生的图像更加清晰,而且能拍摄细胞的数量也不比它少。Fritjof Helmchen是物理学家出身,现为苏黎世大学的神经科学家。据他所说,Mini2P所达到的分辨率跟大型台式双光子系统“几乎一样优秀”。而且Mini2P还是开源的,零件表和教学视频GitHub均可获取。去年12月,有16位研究人员每人支付5500欧元,参加科维理研究所主办的三日工作坊,组装自己的双光子迷你显微镜。

Mini2P使宗伟健因此荣获今年的Tycho Jæger奖,该奖项由挪威物理学会及Jæger基金会共同设立——“为困难到几乎不可能的科学问题,打开了一扇解开谜题的大门”,神经科学家Denise Cai说,她任职于纽约西奈山伊坎医学院。而这一成果经历了多年的研发。

荧光显微镜的基础原理很简单:分子吸收能量后变成电激发态;分子“放松”时就会发出光线。大多显微镜都如此设计,让单光子光能就足以引发上述反应。但这个在较厚组织里就产生了问题:光线通过细胞层时会被吸收、被分散。双光子显微镜利用多个较长波长的光子避免了这个问题,这些光子能更深地穿透组织。但是双光子系统很笨重,还需要专门的光源和镜片。研究人员已经钻研了二十多年,想把双光子技术压缩到轻量小型的设备里,能用于自由活动的动物。

Helmchen是一位早期先驱人物。他做博士后研究员的地方后来称为贝尔实验室,是位于新泽西的一家研发公司。Helmchen和同事发明了第一台便携式双光子显微镜。他们在2001年报道了自己的概念验证性装置——2米长柔性系索将超快脉冲激光器连接到一个25克的显微镜上,可以安在大鼠头上[2]

这一设计首次表明,便携式双光子微型显微镜,能记录从单个神经元分叉突起处释放的钙信号——但仅限于麻醉后、头固定的大鼠。记录过程也相当繁琐。研究人员需要手工给细胞注射钙敏感染料,每次一个,等细胞亮起来之后,再把显微镜戴到大鼠头上,然后找到这个细胞,再尝试拍摄视频。团队在几个月内仅成功拍摄了七个神经元,Helmchen说,每次实验只能拍摄单个细胞。

又过了八年之久,能显示自由活动动物钙信号的头戴式双光子显微镜才问世。2009年,德国研究人员开发了一套重5.5g的便携系统,能一次追踪最多20个神经元。他们拍摄的是大鼠在半圆形场地上跑动时其视皮层神经元的图像[3],神经元内有大量的钙示踪剂。但这样的设计没能获得太大关注,Helmchen说,部分原因是系统太复杂。

单光子的成功

宗伟健当时在北京大学读工程学本科二年级,研究激光方向。但是他真正想做的——“最终梦想”,他说——是“理解自然”。他在2012年师从生物医学工程师程和平,开始自己的博士研究。程和平的实验室在北京大学,研发生物研究用的荧光显微镜技术。

到了这个时候,单光子微型显微镜开始普及。设备重量轻、性能稳定,足可用于非常活跃的小鼠,还能同时拍摄上千个细胞,让研究人员能解读完整的神经网络,而不是一丁点细胞。这些设备也可以检测GCaMP6,这种超敏感钙感受器发明于最早的双光子雏形问世之后。单光子显微镜已用于追踪多种动物行为,包括空间记忆、歌唱发声和睡眠等,这种显微镜“已经取得巨大成功”,Helmchen评价道。

Inscopix是一家加州生物技术公司,据公司首席商务官Martin Verhoef说,从2011年起,公司已经销售了约1500台单光子微型显微镜,送往650多个实验室,利用这项技术发表的文章“超过220篇”。不同配置的设备价格在50000–150000美元之间。

其他开源的选择有加州大学洛杉矶分校的单光子微型显微镜,GitHub上配有其设备说明、配套软件、组装指南。批量采购部件费用约为500美元,DIY套装为1200美元。组装好的UCLA微型显微镜约2000美元,可购自柏林LabMaker公司和里斯本Open Ephys Production Site等公司。

Mini2P设备可记录单个小鼠身上300个网格细胞。图源:W. Zong et al., Cell (CC BY 4.0)

UCLA微型显微镜从发明并公布后的十多年内,全球约有500个实验室用过该设备,神经科学家Peyman Golshani说,他在UCLA的实验室帮助开发了这个设备。比方说,研究人员已把它应用于研究编码跨时记忆的神经元。

尽管性能卓著,单光子微型显微镜通常的拍摄深度不超过几百微米,而且因此得到的荧光图像会失焦、模糊。这对海马区等脑区一般不成问题,这些地方只有小部分细胞亚群在放电,所以细胞零散,足可在模糊图像中识别出来,Edvard Moser说。他和May-Britt Moser共同领导系统神经科学科维理研究所。

但这种分辨率给Moser实验室带来了一个问题。这里的研究人员研究网格细胞——一种专职存储位置、距离、方向信息的神经元。发现网格细胞的这项成果,让两位Moser共享了2014年诺贝尔生理学或医学奖。但是单光子显微镜“不足以”成像网格细胞,May-Britt Moser说,“必须得有双光子系统的分辨率。”

微型显微镜合作

这时宗伟健出现了。2015年,他是程和平团队的一员,这个团队获得了一笔资助用于开发新型设备,尝试结合单光子微型显微镜的轻量和大型台式双光子系统的亚细胞分辨率。

2017年,他们报道了一种快速、高分辨、小型双光子显微镜,这台设备能生成一小时的录像,记录神经细胞微小突起的神经活动[4]。显微镜的分辨率几乎同于大型台式双光子系统。

研究人员用了一种定制的光子晶体纤维——类似于电信领域用来传送信息的快速短光脉冲。这种纤维能传送920纳米的激光脉冲,这个波长能激发GCaMP6。团队增加了一个小物镜,比早先设计的分辨力更高,用一个定制的扫描反射镜来提高设备拍照速度。最终的设备能拍摄活跃小鼠的大脑活动,小到神经突触水平。

据Edvard Moser说,这种微型显微镜“已经是一次革命性进展”。“它表现出真的能在移动动物身上以高分辨率和高稳定性拍摄细胞。”他说。“人们深为震撼”——尤其是他自己。

Edvard Moser第一次见到宗伟健,是在2017年10月北京郊外的一次学术会议上。Moser看到了双光子微型显微镜的潜力,他很兴奋,安排行程参观程和平的实验室。宗伟健去接送Moser。

两小时车程中的聊天中,Moser了解到更多关于双光子微型显微镜的内容。“显微镜分辨率优越,重量也挺不错。”他说。但是这种微型显微镜视野太小,只能拍摄几十个细胞——对于Moser和同事所需来说太少了。“细胞太少就观察不到模式了。”他说。相比之下,商业台式双光子显微镜能拍摄面积超过一平方毫米。

但这一初代设备相对于过去的双光子头戴式设计是一次巨大进步,Moser说。只是需要“再多一点点就能派上用场”。

25张连续视野的合成图,显示了2种厚度的共10000个细胞(蓝色,100μm;紫红色,140μm)。图源:W. Zong et al./Cell (CC BY 4.0)

六个月后,宗伟健搬到挪威,加入科维理研究所。在这里,他可以继续开发双光子微型显微镜,渴望用上这项技术的生物学家们向他提供各种建议和帮助。Moser实验室花了二十多年研究空间导航——即动物在移动中追踪位置和方向改变的能力。这项复杂的行为受网格细胞网络调控,能在动物在开放空间寻路时有规律地间断放电。但要解释这些专职神经元如何相互协调,需要对自由活动的动物进行仔细的检查。

去年,宗伟健和他在中国的同事报道了他们的第二代微型显微镜[5],视野扩大、工作距离加长,能让研究人员扫描多个平面,成像体积达420 × 420 × 180微米。第二代设备很稳定,能够连续数周在同一脑区记录神经活动。

但是性能提升也有代价。显微镜变重了,绳子变硬了,这就会限制小鼠活动的自由度,May-Britt Moser说。还有就是,该设计内有一个电调变焦镜头,它在研究人员上下移动设备时温度会升高。高温会导致视觉位移,从而改变细胞在视野中的位置。“这对神经科学家就是场灾难,因为这样你没法观察同一细胞的长时间活动了。”Edvard Moser说。

在特隆赫姆,宗伟健发现了另一款变焦镜头TLens,由挪威光学技术公司poLight制造。

TLens为智能手机和智能手表相机设计,可能也适合双光子微型显微镜,宗伟健说。它又小又快,并且得益于其完全不同的光功率调节机制,它的热稳定性更好。TLens只需要两处调整。第一处,宗伟健和福州逐日光电科技合作,更换TLens的光学涂层让它能兼容双光子激光波长。第二处,poLight的科学家制作了一叠四个可调透镜来扩展光学视距,并把它整合到新的微型显微镜上[1]

TLens组合让Mini2P能多平面拍摄,实际上产生了大块组织的图像。这把研究人员记录神经元的数量提高到千个——类似于单光子显微镜能记录的数量。Helmchen说这是一次“重大进步”。重要的是,微型透镜和更软的系绳让小鼠能活动不受限——相比2021年时比较笨重的设计是个关键提升。

“的论文很好地表明,新一代微型显微镜记录的小鼠行为类似于没戴显微镜。”Yaniv Ziv说。他是以色列魏茨曼科学研究所的神经科学家。“它也是令人惊叹并且对实验非常重要的成果,能在更加接近自然的状态下,在小鼠较剧烈运动时还能保持视野稳定。”

Ziv是加入科维理研究所12月工作坊、自己组装Mini2P的16名研究人员之一。他的实验室用的是单光子显微镜,研究长时记忆在海马区编码的方式,但是研究人员无法分辨深层和浅层的细胞。他说,Mini2P或许能成功实现单光子微型显微镜无法呈现的内容。另一位工作坊参加者,美国国立卫生研究院神经科学家Yi Gu,研究的是大脑编码空间信息的方式,用的是台式双光子显微镜记录细胞,小鼠头部是固定的,沿着虚拟的线性道路导航。但是这个实验的设备无法记录定向神经元这样的细胞,这种细胞能感知头部位置和运动变化。Gu希望Mini2P能支持她完成这些实验,让自由活动的小鼠在真实环境中导航。

复杂设备

其他研究人员也在追求更好的微型双光子显微镜。八月,就在科维理团队报道了Mini2P几个月后,由Golshani领导的另一独立团队获得了四百万美元的经费,由NIH的“利用先进创新神经技术进行大脑研究计划”资助,用于开发两种新型双光子微型显微镜:一是视野800 × 800 µm的小鼠显微镜——视野几乎是Mini2P的两倍,可媲美于台式双光子设备;另外一个设备,将来会让研究人员在大鼠和较大动物身上同时拍摄多个大脑层。而宗伟健说,在他这边,他和同事“一定会继续开发Mini2P,让它更广、更快、更深”。

更困难的部分可能是社群接纳。对于开源工具开发者来说,让系统保持稳定,让不是显微镜专家的人也能上手组装和维修,这两点特别有挑战性,Ziv说。双光子显微镜尤为如此。这种设备要求能生成超快速、高功率光脉冲激光器,造价达20万美元。“标价就让很多研究团队望而却步。”Cai说。双光子系统也比单光子设备复杂许多,所以构建和应用Mini2P都需要大量的技术专业知识。

而在特隆赫姆,Mini2P的开发工作仍在持续。有了3个版本。“工作只是刚开始。”宗伟健说,“技术一旦发表过就是旧技术了。”

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每日消息!最美人间四月天 金普喊你来赏春

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环球微资讯!司法部今日公布2022年度国家统一法律职业资格主观题考试成绩

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志丹县气象台发布大雾黄色预警【Ⅲ级/较重】【2023-04-25】_天天播报

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河北批准建设用地面积同比增长90.25%

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全球今日报丨怀旧经典 《火星叔叔马丁第一季》(自译中字)美国1963年 My Favorite Martian

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焦点短讯!孙中义

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广安发布干部任前公示 张红平拟任正县级领导职务

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焦点播报:石世情缘

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首破100亿大关!亿晶光电2022扭亏为盈

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歌尔股份(002241):一季度营收同比增长20% 净利润短期承压

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